Kromatografia ya kioevu ndio njia kuu ya kupima yaliyomo katika kila sehemu na uchafu katika malighafi, viunganishi, maandalizi na vifaa vya ufungaji, lakini vitu vingi havina njia za kawaida za kutegemea, kwa hivyo ni lazima kuunda njia mpya. Katika ukuzaji wa njia za awamu ya kioevu, safu ya chromatographic ndio msingi wa kromatografia ya kioevu, kwa hivyo jinsi ya kuchagua safu inayofaa ya kromatografia ni muhimu. Katika makala hii, mwandishi ataelezea jinsi ya kuchagua safu ya chromatography ya kioevu kutoka kwa vipengele vitatu: mawazo ya jumla, mazingatio na upeo wa maombi.
A. Mawazo ya jumla ya kuchagua safu wima za kromatografia
1. Tathmini sifa za kimaumbile na kemikali za kichanganuzi: kama vile muundo wa kemikali, umumunyifu, uthabiti (kama vile ikiwa ni rahisi kuoksidishwa/kupunguzwa/hidrolisisi), asidi na alkali, n.k., hasa muundo wa kemikali ndio ufunguo. sababu katika kuamua mali, kama vile kundi conjugated ina nguvu ultraviolet ngozi na fluorescence nguvu;
2. Kuamua madhumuni ya uchambuzi: ikiwa utengano wa juu, ufanisi wa safu ya juu, muda mfupi wa uchambuzi, unyeti wa juu, upinzani wa shinikizo la juu, maisha ya safu ya muda mrefu, gharama ya chini, nk inahitajika;
- Chagua safu wima inayofaa ya kromatografia: elewa muundo, sifa za kimwili na kemikali za kichujio cha kromatografia, kama vile saizi ya chembe, saizi ya pore, uvumilivu wa halijoto, uvumilivu wa pH, utangazaji wa kichanganuzi, n.k.
- Mazingatio ya kuchagua nguzo za kromatografia ya kioevu
Sura hii itajadili mambo ya kuzingatiwa wakati wa kuchagua safu ya kromatografia kutoka kwa mtazamo wa sifa za kimwili na kemikali za safu yenyewe ya kromatografia. 2.1 Matrix ya kujaza
2.1.1 Matrix ya jeli ya silika Matrix ya kichungi ya safu wima nyingi za kromatografia kioevu ni jeli ya silika. Aina hii ya kichujio ina usafi wa juu, gharama ya chini, nguvu ya juu ya mitambo, na ni rahisi kurekebisha vikundi (kama vile kuunganisha phenyl, kuunganisha amino, kuunganisha cyano, n.k.), lakini thamani ya pH na kiwango cha joto kinachostahimili ni mdogo: Aina ya pH ya vijazaji vingi vya matrix ya gel ya silika ni 2 hadi 8, lakini safu ya pH ya awamu zilizounganishwa za jeli ya silika iliyorekebishwa maalum inaweza kuwa pana kama 1.5 hadi 10, na pia kuna awamu za kuunganishwa kwa jeli ya silika iliyorekebishwa ambayo ni thabiti katika pH ya chini. kama vile Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, ambayo ni thabiti katika pH 1 hadi 8; kikomo cha joto cha juu cha tumbo la gel ya silika kawaida ni 60 ℃, na baadhi ya nguzo za kromatografia zinaweza kuhimili joto la 40 ℃ katika pH ya juu.
2.1.2 Matrix ya polima Vijazaji vya polima mara nyingi ni polystyrene-divinylbenzene au polymethacrylate. Faida zao ni kwamba wanaweza kuvumilia pH mbalimbali - zinaweza kutumika katika aina mbalimbali za 1 hadi 14, na zinakabiliwa zaidi na joto la juu (linaweza kufikia zaidi ya 80 ° C). Ikilinganishwa na vijazaji vya C18 vilivyo na silika, aina hii ya kichujio ina haidrofobi yenye nguvu zaidi, na polima kubwa ni nzuri sana katika kutenganisha sampuli kama vile protini. Hasara zake ni kwamba ufanisi wa safu ni chini na nguvu ya mitambo ni dhaifu kuliko ya fillers ya silika. 2.2 Umbo la chembe
Vichungi vingi vya kisasa vya HPLC ni chembe za spherical, lakini wakati mwingine ni chembe zisizo za kawaida. Chembe za spherical zinaweza kutoa shinikizo la chini la safu, ufanisi wa safu ya juu, utulivu na maisha marefu; wakati wa kutumia awamu za simu za juu-mnato (kama vile asidi ya fosforasi) au wakati sampuli ya ufumbuzi ni ya viscous, chembe zisizo za kawaida zina eneo kubwa zaidi la uso, ambalo linafaa zaidi kwa hatua kamili ya awamu mbili, na bei ni ya chini. 2.3 Ukubwa wa chembe
Ukubwa mdogo wa chembe, juu ya ufanisi wa safu na juu ya kujitenga, lakini mbaya zaidi upinzani wa shinikizo la juu. Safu inayotumiwa zaidi ni safu ya ukubwa wa chembe 5 μm; ikiwa mahitaji ya utenganisho ni ya juu, kichujio cha 1.5-3 μm kinaweza kuchaguliwa, ambacho kinafaa kwa kutatua tatizo la utengano wa baadhi ya sampuli changamano za matrix na vipengele vingi. UPLC inaweza kutumia vichungi vya 1.5 μm; 10 μm au vijazaji vya ukubwa wa chembe kubwa zaidi hutumiwa mara nyingi kwa safu wima zinazotayarisha nusu au matayarisho. 2.4 Maudhui ya kaboni
Maudhui ya kaboni inarejelea uwiano wa awamu iliyounganishwa kwenye uso wa gel ya silika, ambayo inahusiana na eneo maalum la uso na chanjo ya awamu iliyounganishwa. Maudhui ya juu ya kaboni hutoa uwezo wa juu wa safu na azimio la juu, na mara nyingi hutumiwa kwa sampuli ngumu zinazohitaji utengano wa juu, lakini kutokana na muda mrefu wa mwingiliano kati ya awamu mbili, muda wa uchambuzi ni mrefu; safu wima za kromatografia za maudhui ya kaboni ya chini zina muda mfupi zaidi wa uchanganuzi na zinaweza kuonyesha uteuzi tofauti, na mara nyingi hutumiwa kwa sampuli rahisi zinazohitaji uchanganuzi wa haraka na sampuli zinazohitaji hali ya juu ya awamu ya maji. Kwa ujumla, maudhui ya kaboni ya C18 ni kati ya 7% hadi 19%. 2.5 Ukubwa wa pore na eneo maalum la uso
Vyombo vya habari vya adsorption vya HPLC ni chembe za porous, na mwingiliano mwingi hufanyika kwenye pores. Kwa hiyo, molekuli lazima iingie kwenye pores ili kutangaza na kutengwa.
Saizi ya pore na eneo maalum la uso ni dhana mbili za ziada. Ukubwa mdogo wa pore unamaanisha eneo kubwa la uso maalum, na kinyume chake. Sehemu kubwa ya uso mahususi inaweza kuongeza mwingiliano kati ya molekuli za sampuli na awamu zilizounganishwa, kuimarisha uhifadhi, kuongeza upakiaji wa sampuli na uwezo wa safu, na utenganisho wa vipengele changamano. Vichungi vya porous kikamilifu ni vya aina hii ya vichungi. Kwa wale walio na mahitaji ya juu ya kujitenga, inashauriwa kuchagua vichungi na eneo kubwa la uso maalum; eneo ndogo la uso maalum linaweza kupunguza shinikizo la nyuma, kuboresha ufanisi wa safu, na kupunguza muda wa usawa, ambao unafaa kwa uchambuzi wa gradient. Vichungi vya ganda la msingi ni vya aina hii ya vichungi. Juu ya msingi wa kuhakikisha utengano, inashauriwa kuchagua vichungi na eneo ndogo maalum la uso kwa wale walio na mahitaji ya juu ya ufanisi wa uchambuzi. 2.6 Kiasi cha pore na nguvu za mitambo
Kiasi cha pore, pia kinachojulikana kama "kiasi cha pore", kinarejelea saizi ya ujazo tupu kwa kila chembe ya kitengo. Inaweza kutafakari vizuri nguvu ya mitambo ya kujaza. Nguvu ya mitambo ya fillers yenye kiasi kikubwa cha pore ni dhaifu kidogo kuliko ile ya fillers yenye kiasi kidogo cha pore. Vijazaji vyenye ujazo wa pore chini ya au sawa na 1.5 mL/g hutumiwa zaidi kutenganisha HPLC, ilhali vichungi vilivyo na ujazo wa pore zaidi ya 1.5 mL/g hutumiwa zaidi kwa kromatografia ya kutengwa kwa molekuli na kromatografia yenye shinikizo la chini. 2.7 Kiwango cha kupunguzwa
Kuweka mkia kunaweza kupunguza kilele cha mkia kinachosababishwa na mwingiliano kati ya misombo na vikundi vya silanoli vilivyofunuliwa (kama vile uunganisho wa ioni kati ya misombo ya alkali na vikundi vya silanoli, nguvu za van der Waals na vifungo vya hidrojeni kati ya misombo ya asidi na vikundi vya silanoli), na hivyo kuboresha ufanisi wa safu na umbo la kilele. . Awamu zilizounganishwa ambazo hazijafungwa zitatoa chaguzi tofauti zinazohusiana na awamu zilizounganishwa, haswa kwa sampuli za polar.
- Upeo wa matumizi ya safu wima tofauti za kromatografia ya kioevu
Sura hii itaelezea wigo wa matumizi ya aina tofauti za safu wima za kromatografia ya kioevu kupitia visa vingine.
3.1 Safu wima ya kromatografia ya awamu iliyogeuzwa ya C18
Safu ya C18 ndiyo safu wima ya awamu ya nyuma inayotumika sana, inayoweza kukidhi majaribio ya maudhui na uchafu wa vitu vingi vya kikaboni, na inatumika kwa vitu vya polar ya wastani, polar dhaifu na zisizo za polar. Aina na vipimo vya safu wima ya kromatografia ya C18 vinapaswa kuchaguliwa kulingana na mahitaji mahususi ya utengano. Kwa mfano, kwa vitu vilivyo na mahitaji ya juu ya kujitenga, vipimo vya 5 μm * 4.6 mm * 250 mm hutumiwa mara nyingi; kwa vitu vilivyo na matrices tata ya kujitenga na polarity sawa, vipimo vya 4 μm * 4.6 mm * 250 mm au ukubwa mdogo wa chembe vinaweza kutumika. Kwa mfano, mwandishi alitumia safu wima ya 3 μm*4.6 mm*250 mm kugundua uchafu wawili wa genotoxic katika API ya celecoxib. Mgawanyiko wa vitu viwili unaweza kufikia 2.9, ambayo ni bora. Kwa kuongeza, chini ya msingi wa kuhakikisha kujitenga, ikiwa uchambuzi wa haraka unahitajika, safu fupi ya 10 mm au 15 mm mara nyingi huchaguliwa. Kwa mfano, mwandishi alipotumia LC-MS/MS kugundua uchafu wa genotoxic katika API ya fosforasi ya piperaquine, safu wima ya 3 μm*2.1 mm*100 mm ilitumiwa. Tofauti kati ya uchafu na sehemu kuu ilikuwa 2.0, na utambuzi wa sampuli unaweza kukamilika kwa dakika 5. 3.2 Safu ya fenili ya awamu iliyogeuzwa
Safu ya phenyl pia ni aina ya safu wima ya awamu iliyogeuzwa. Aina hii ya safu ina uwezo wa kuchagua kwa misombo ya kunukia. Ikiwa mwitikio wa misombo ya kunukia iliyopimwa na safu wima ya C18 ni dhaifu, unaweza kufikiria kuchukua nafasi ya safu wima ya phenyl. Kwa mfano, nilipokuwa nikitengeneza API ya celecoxib, jibu la sehemu kuu lililopimwa kwa safu wima ya phenyl ya mtengenezaji sawa na vipimo sawa (zote 5 μm*4.6 mm*250 mm) ilikuwa takriban mara 7 ya safu wima ya C18. 3.3 Safu ya awamu ya kawaida
Kama nyongeza inayofaa kwa safu ya awamu iliyogeuzwa, safu wima ya awamu ya kawaida inafaa kwa misombo ya polar sana. Ikiwa kilele bado ni cha haraka sana wakati wa kufichua na zaidi ya 90% ya awamu ya maji katika safu wima ya awamu iliyogeuzwa, na hata karibu na kuingiliana na kilele cha kutengenezea, unaweza kufikiria kuchukua nafasi ya safu ya awamu ya kawaida. Aina hii ya safu inajumuisha safu ya hilic, safu ya amino, safu ya cyano, nk.
3.3.1 Safu ya hiliki Safu ya hiliki kwa kawaida hupachika vikundi vya haidrofili kwenye mnyororo wa alkili uliounganishwa ili kuimarisha mwitikio kwa dutu za polar. Aina hii ya safu inafaa kwa uchambuzi wa vitu vya sukari. Mwandishi alitumia aina hii ya safu wakati wa kufanya maudhui na dutu zinazohusiana za xylose na derivatives yake. Isoma ya derivative ya xylose pia inaweza kutengwa vizuri;
3.3.2 Safu ya amino na safu ya cyano Safu ya amino na safu ya siano inarejelea kuanzishwa kwa marekebisho ya amino na saino mwishoni mwa mnyororo wa alkili uliounganishwa, mtawaliwa, ili kuboresha uteuzi wa vitu maalum: kwa mfano, safu ya amino ni chaguo nzuri. kwa ajili ya mgawanyo wa sukari, amino asidi, besi, na amides; safu wima ya cyano ina uteuzi bora wakati wa kutenganisha dutu za kimuundo zenye hidrojeni na zisizo na hidrojeni kwa sababu ya uwepo wa vifungo vilivyounganishwa. Safu ya amino na safu ya siano mara nyingi zinaweza kubadilishwa kati ya safu ya awamu ya kawaida na safu ya awamu ya nyuma, lakini kubadili mara kwa mara hakupendekezi. 3.4 Safu ya Chiral
Safu ya chiral, kama jina linavyopendekeza, inafaa kwa utenganishaji na uchambuzi wa misombo ya chiral, hasa katika uwanja wa dawa. Aina hii ya safu inaweza kuzingatiwa wakati safu za kawaida za awamu ya nyuma na ya kawaida haziwezi kufikia mgawanyiko wa isoma. Kwa mfano, mwandishi alitumia safu wima ya 5 μm*4.6 mm*250 mm kutenganisha isoma mbili za 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine na (1R, 2R) -1, 2. -diphenylethylenediamine, na utengano kati ya hizo mbili ulifikia takriban 2.0. Hata hivyo, safu wima ni ghali zaidi kuliko aina nyingine za safuwima, kwa kawaida 1W+/kipande. Ikiwa kuna haja ya safu kama hizo, kitengo kinahitaji kufanya bajeti ya kutosha. 3.5 Safu ya ubadilishaji wa ion
Safu wima za kubadilishana ioni zinafaa kwa utenganishaji na uchanganuzi wa ayoni zilizochajiwa, kama vile ayoni, protini, asidi nukleiki na baadhi ya vitu vya sukari. Kulingana na aina ya kichujio, zimegawanywa katika safu wima za kubadilishana mawasiliano, safu wima za kubadilishana anion, na safu wima thabiti za kubadilishana kasheni.
Safu wima za kubadilishana cation ni pamoja na safu wima zenye msingi wa kalsiamu na hidrojeni, ambazo zinafaa zaidi kwa uchanganuzi wa dutu kaniki kama vile asidi ya amino. Kwa mfano, mwandishi alitumia nguzo zenye msingi wa kalsiamu wakati wa kuchambua gluconate ya kalsiamu na acetate ya kalsiamu katika suluhisho la kusafisha. Dutu zote mbili zilikuwa na majibu yenye nguvu kwa λ=210nm, na kiwango cha utengano kilifikia 3.0; mwandishi alitumia nguzo zenye msingi wa hidrojeni wakati wa kuchambua vitu vinavyohusiana na glucose. Dutu kadhaa kuu zinazohusiana - maltose, maltotriose na fructose - zilikuwa na usikivu wa juu chini ya vigunduzi tofauti, na kikomo cha kugundua kilikuwa chini kama 0.5 ppm na digrii ya utengano ya 2.0-2.5.
Nguzo za kubadilishana anion zinafaa zaidi kwa uchanganuzi wa vitu vya anionic kama vile asidi za kikaboni na ioni za halojeni; safu kali za ubadilishanaji wa cations zina uwezo wa juu wa kubadilishana ioni na kuchagua, na zinafaa kwa utenganishaji na uchambuzi wa sampuli changamano.
Yaliyo hapo juu ni utangulizi tu wa aina na safu za matumizi ya safu wima kadhaa za kawaida za kromatografia ya kioevu pamoja na uzoefu wa mwandishi mwenyewe. Kuna aina zingine maalum za safu wima za kromatografia katika matumizi halisi, kama vile safu wima zenye vinywele vikubwa, safu wima za kromatografia zenye vinywele vidogo, safu wima za kromatografia, safu wima za kromatografia ya hali ya juu, safu wima za kromatografia ya kioevu ya utendaji wa hali ya juu (UHPLC), safu wima za kromatografia ya majimaji ya juu sana. SFC), nk Wanacheza jukumu muhimu katika nyanja tofauti. Aina maalum ya safu ya chromatographic inapaswa kuchaguliwa kulingana na muundo na mali ya sampuli, mahitaji ya kujitenga na madhumuni mengine.
Muda wa kutuma: Juni-14-2024